Objetivos:
1-Preparar experimentalmente diferentes soluciones amortiguadoras.
2-Determinar el pH de las soluciones anteriormente preparadas.
3-Establecer la relación entre el pH y un amortiguador.
Marco Teórico:
Solución amortiguadora es aquella que se opone los cambios de pH cuando se agrega ácido o álcali. Tales soluciones se utilizan en muchos experimentos bioquímicos en los cuales se necesita controlar exactamente el pH.
De la ecuación de Henderson-Hasselbalch, se puede deducir que el pH de una solución amortiguadora depende de dos factores uno es el de pKa y el otro es la proporción de sal a ácido. Esta proporción se considera igual a las cantidades de sal y ácido mezcladas en el intervalo de pH entre 4 y 10, donde la concentración de hidrogeniones e hidroxilos del medio acuoso son muy baja y se puede ignorar.
PH = pKa + log 10 [sal] / [ácido]
Tomemos por ejemplo los amortiguadores de acetato que están compuestos por una mezcla de ácido acético y acetato de sodio:
CH3COOH ↔ CH3COO- + H+
CH3COONa → CH3COO- + Na+
Puesto que el ácido acético está tan solo débilmente disociado, la concentración de ácido será casi la misma que se agregó a la mezcla; en la misma forma la concentración de iones acetato puede ser considerada como igual a la concentración de acetato de sodio añadido a la mezcla, ya que la sal estará completamente disociada. La máxima capacidad amortiguadora de la solución se cumple cuando la concentración de la sal es igual a la concentración del ácido, en este punto pH = pKa. Si el pKa del ácido acético es 4.8, en la práctica las soluciones amortiguadoras se usan en el intérvalo de pH entre 3.8 y 5.8, es decir 1 unidad alrededor del pKa. Esto se cumple generalmente para todas las soluciones amortiguadoras.
Como se dijo anteriormente, el intervalo útil para la mayoría de los amortiguadores es de una unidad de pH por encima o por debajo del valor de pKa.
El amortiguador que se escoja en un momento dado debe seleccionarse con cuidado, ya que los resultados experimentales pueden deberse a efectos específicos de los iones utilizados y no al pH. Algunos amortiguadores que producen reacciones desfavorables son: boratos, citratos, fosfatos y tris.
Materiales y reactivos
*Probetas
*Tubos de ensayos
*Potenciómetro
*Papel parafilm
*Espátulas
* Fosfato monobásico de potasio
* Ácido cítrico
* Citrato trisódico
* Fosfato dibásico de sodio
*HCl
*NaOH
TOXICIDAD DE LOS REACTIVOS
*Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4): Grandes dosis puede provocar transtornos gastrointestinales. Irritación y ardor en los ojos. Irritación y enrojecimiento de la piel.No ES uma sustância cancerígena.
*Ácido cítrico:
Inhalación: Causa Irritación Del tracto respiratorio con síntomas como tos, falta de respiración.
Ingestión: Causa irritación del tracto gastrointestinal. Los síntomas pueden ser náuseas, vómitos y diarrea. Dosis orales extremadamente altas pueden producir malestar gastrointestinal. En casos de ingestión severa se puede producir deficiencia de calcio en la sangre.
Contacto con la Piel: Causa irritación de la piel. Los síntomas incluyen enrojecimiento.
*Citrato trisódico: Las grandes cantidades de este producto pueden causar náuseas, vómitos, calambres y producir irritación acídica de la boca y la garganta. Irritación. Algunas reacciones alérgicas.
*Fosfato dibásico de sodio: Irritaciones en la nariz y tracto respiratorio. Tos y dificultad respiratoria.
Contacto con La Piel: Posibles irritaciones. Enrojecimiento y dolor.
Contacto con los Ojos: Irritaciones. Enrojecimiento y dolor.
Ingestión: Nocivo leve.
* Hidróxido de sodio: Corrosivo. Sensación de quemazón, tos, dificultad respiratoria. Causa graves lesiones en los ojos, dejando con frecuencia secuelas como opacidad de la córnea, glaucoma o cataratas.
Su ingestión produce lesiones importantes en la boca, tráquea y faringe. Hemorragia e incluso perforaciones digestivas que pueden originar shock.
Se puede producir también estenosis digestiva
*HCl: Corrosivo e irritante de las vías respiratorias superior e inferior, piel y ojos. Produce quemadura en la piel, y las mucosas se irritan, de modo similar a la exposición con ácidos inorgánicos volátiles.
Los síntomas, incluyen secreción lagrimal, tos, respiración dificultosa y excesiva salivación con formación de esputo. Una excesiva irritación de los pulmones causa neumonía aguda y edema pulmonar, que pueden resultar fatales.
Las quemaduras producidas por ácido clorhídrico son muy dolorosas, producen enrojecimiento, posible hinchazón y rápida necrosis.
El punto isoeléctrico se define como el pH en el cual el número de cargas positivas se iguala al número de cargas negativas que aportan los grupos ionizables de una molécula. En el punto isoeléctrico la carga neta de la molécula es cero (0). En los aminoácidos los grupos ionizables corresponden a grupos carboxilos, amino, fenólicos y tiólicos.
El pI de los a-aminoácidos monoamino-monocarboxílicos, siempre está cercano a pH = 6.
Los aminoácidos y las proteínas son menos solubles en su punto isoeléctrico si las demás condiciones permanecen iguales. Esto se debe a que los iones dipolares no presentan carga neta y cristalizan en forma de sales insolubles a ese pH.
*NaOH: Corrosivo. Sensación de quemazón, tos, dificultad respiratoria. Causa graves lesiones en los ojos, dejando con frecuencia secuelas como opacidad de la córnea, glaucoma o cataratas. Su ingestión produce lesiones importantes en la boca, tráquea y faringe. Hemorragia e incluso perforaciones digestivas que pueden originar shock.
DISEÑO EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO 2
PUNTO ISOELÉCTRICO DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS
Objetivos:
1. Determinar los pKa de un aminoácido polar con carga y un aminoácido no polar, mediante titulación con álcali.
2. Estimar el punto isoeléctrico de los aminoácidos polares y no polares del gráfico de pH vs volumen de base.
3. Determinar el punto isoeléctrico de una proteína mediante la técnica de precipitación.
Marco Teórico
El pI de los a-aminoácidos monoamino-monocarboxílicos, siempre está cercano a pH = 6.
El pI de los á-aminoácidos monoamino-dicarboxílicos se encuentra a un pH intermedio entre los valores de pKa de los grupos carboxílicos y en el caso de los á-aminoácidos diamino-monocarboxílicos entre los valores de pKa de los grupos amino.
Los puntos isoeléctricos proporcionan información útil para razonar sobre el comportamiento de los aminoácidos y proteínas en solución. Así, la presencia de grupos ionizables en estas moléculas tiene importantes consecuencias sobre la solubilidad.
Los aminoácidos y las proteínas son menos solubles en su punto isoeléctrico si las demás condiciones permanecen iguales. Esto se debe a que los iones dipolares no presentan carga neta y cristalizan en forma de sales insolubles a ese pH.
Materiales y reactivos
-Buretas
- soportes
- pinzas de bureta
- matraces de 125 mL y 250 mL
- pipetas de 25 ml
-potenciómetro de pH.
*Soluciones de ác. Glutámico y glicina al 0.5% en HCl 0.1M;
* NaOH 0.2M; HCl 2%
*leche de vaca
* Etanol 95%
* Éter.
TOXICIDAD DE LOS REACTIVOS
*Ác. Glutámico: es uno de los 20 aminoácidos que forman parte de las proteínas. El ácido glutámico es crítico para la función celular y no es nutriente esencial porque en el hombre puede sintetizarse a partir de otros compuestos.
* Glicina: Combustible, Nocivo e Irritante leves
* Etanol: es un líquido incoloro, volátil, con un olor característico y sabor picante. Por ser un producto inflamable, los vapores pueden llegar a un punto de ignición, prenderse y transportar el fuego hacia el material que los originó.
En general, es incompatible con ácidos, cloruros de ácido, agentes oxidantes y reductores y metales alcalinos. Existen evidencias de toxicidad al feto y teratogenicidad en experimentos con animales de laboratorio tratados con dosis grandes durante la gestación. El etanol induce el aborto.
*HCl: Corrosivo e irritante de las vías respiratorias superior e inferior, piel y ojos. Produce quemadura en la piel, y las mucosas se irritan, de modo similar a la exposición con ácidos inorgánicos volátiles.
Los síntomas, incluyen secreción lagrimal, tos, respiración dificultosa y excesiva salivación con formación de esputo. Una excesiva irritación de los pulmones causa neumonía aguda y edema pulmonar, que pueden resultar fatales.
*NaOH: Corrosivo. Sensación de quemazón, tos, dificultad respiratoria. Causa graves lesiones en los ojos, dejando con frecuencia secuelas como opacidad de la córnea, glaucoma o cataratas. Su ingestión produce lesiones importantes en la boca, tráquea y faringe. Hemorragia e incluso perforaciones digestivas que pueden originar shock.
Experimento 3.
Pruebas Cualitativas para aminoácidos y proteínas
Objetivos:
1. Aplicar pruebas cualitativas generales y específicas que permitan reconocer grupos químicos de los aminoácidos y proteínas.
2. Someter soluciones de proteínas a desnaturalización con agentes físicos y químicos.
Marco Teórico:
1. Reacción con la ninhidrina: Los grupos amino libres de los aminoácidos, de los péptidos y las proteínas reaccionan con la ninhidrina a un pH entre 4 y 8, para dar un compuesto de intenso color azul púrpura. La prueba también es positiva con aminas primarias y amoníaco pero sin desprendimiento de CO2 . Los aminoácidos prolina e hidroxiprolina dan un color amarillo en lugar del color púrpura con la ninhidrina.
La reacción es muy sensible y es ideal para la detección de aminoácidos en cromatogramas y para su cuantificación mediante técnicas espectrofotométricas de las fracciones que se obtienen de columnas cromatografías.
2. Reacción xantoproteica: Los aa, que contienen un núcleo aromático forman nitroderivados de color amarillo cuando se calientan con ácido nítrico concentrado. Las sales de estos derivados son de color naranja intenso en medio alcalino. La fenilalanina, la tirosina y en cierto grado el Triptófano, así como todas las proteínas que los contienen, dan positiva la prueba.
3. Reacción del ácido glioxílico para triptófano: El grupo indólico del triptófano reacciona con ácido glioxílico en presencia de ácido sulfúrico concentrado dando un complejo de color púrpura. El ácido acético glacial que ha sido expuesto a la luz contiene ácido glioxílico.
4. Reacción para el triptófano: Este aminoácido se condensa fácilmente con varios aldehídos en presencia de ácidos fuertes para dar compuestos coloreados. En la reacción se utiliza el reactivo de Ehrlich (p-dimetilaminobenzaldehído al 10% en HCL conc.) que reacciona con un buen número de compuestos orgánicos tales como indoles, aminas aromáticas y compuestos ureicos para dar complejos coloreados.
5. Reacciones para cisteína y cistina: Cuando los aa y las proteínas que contienen grupos tiólicos se calientan en medio fuertemente alcalino, el azufre presente reacciona para formar sulfuros. Este sulfuro puede detectarse por la formación de un precipitado negro de sulfuro de plomo por adición de acetato de plomo.
Los grupos tioles también reaccionan con el nitroprusiato de sodio en presencia de un exceso de amoníaco para dar un complejo de color rojo.
6. Prueba para Arginina: El aa. Arginina contiene un grupo guanidino en la cadena lateral, este grupo reacciona con el reactivo de Sakaguchi (a-naftol/agua de Bromo) en medio alcalino para dar un compuesto de color rojo.
Pruebas generales de las proteínas:
1. Prueba de Biureth: Los compuestos que tienen dos grupos carbamidos (-CONH-), ya sea unidos directamente o a través de un átomo de carbono o nitrógeno, dan un color violeta con el sulfato de cobre alcalino (Reactivo de Biureth). Los tripéptidos son las moléculas más pequeñas capaces de dar una prueba de Biureth positiva, mientras que esto no ocurre con los aminoácidos.
La prueba de Biureth es una buena prueba general para las proteínas y la intensidad del color violeta es una medida del número de enlaces peptídicos. Algunas sustancias como la oxamida pueden dar falsos resultados positivos en ensayos cualitativos de proteínas.
2. Desnaturalización por calor y pH extremos: La desnaturalización es cualquier proceso por el cual el arreglo espacial de una proteína cambia de la estructura ordenada de la molécula nativa a una forma tridimensional desordenada. Durante la desnaturalización se pierden las estructuras de orden superior de las proteínas, con pérdida de la actividad biológica. Las enzimas por ejemplo, que realizan trabajos catalíticos en las células, tienen una temperatura y un pH óptimo en el cual presentan un máximo de actividad, pero la actividad disminuye significativamente hacia valores extremos de pH y a bajas o elevadas temperaturas.
3. Precipitación con cationes y aniones pesados y sales concentradas: Los cationes de metales pesados y los aniones de elevado peso molecular son muy usados en la separación de proteínas y en la preparación de filtrados libres de proteínas. A pH neutro por lo general las proteínas tienen carga neta negativa y se combinan fácilmente con iones de metales pesados que, al neutralizar la carga producen la precipitación. A pH por debajo del punto isoeléctrico en cambio, se combinan con aniones porque presentan carga neta positiva. Soluciones concentradas de sales, de sulfato de amonio, por ejemplo, reducen en gran medida la solubilidad de las proteínas, porque compiten por las moléculas de agua de disponibles para la solvatación y las interacciones proteína-proteína se hacen más importantes.
Materiales y Reactivos.
a). Tubos de ensayo, gradillas, goteros, baño maría.
b).Soluciones al 1% en HCL IM de glicina, tirosina, triptófano, Cisteína, cistina, prolina, hidroxiprolina, arginina y fenilalanina. Soluciones al 1% de albúmina, caseína y gelatina. Reactivo de Beirut, HNO3 conc., NaOH 1OM, ác. Acético glacial, acetato de plomo II al 2%, ac. Pícrico saturado, ác, Tricloroacético al 5%.
Toxicidad de los Reactivos
HNO3 concentrado: se descompone lentamente por la acción de la luz, adoptando una coloración amarilla por el NO2 que se produce en la reacción. En el aire húmedo despide humos blancos, su punto de fusión es de -43 ºC y su punto de ebullición es de 83 ºC pero a esa temperatura se acentúa su descomposición. Es soluble en agua en cualquier proporción y cantidad y su densidad es de 1,5 g/mL
NaOH: que es muy corrosivo (tanto en solución como en sólido). Siempre que se preparen soluciones patrón de álcalis como NaOH o KOH se debe proteger la cara, así como usar guantes y ropa adecuada. Si el reactivo entra en contacto con la piel, inmediatamente lave el área con abundantes cantidades de agua. En caso de ingestión acuda lo más pronto posible a un centro de salud.
Ácido Acético glacial: Irritaciones en vías respiratorias. Sustancia muy corrosiva. Puede provocar bronconeumonía, edemas en el tracto respiratorio.
En la piel CAUSA quemaduras. Trastornos de visión, ceguera (lesión irreversible del nervio óptico). Quemaduras en mucosas.
En la piel CAUSA quemaduras. Trastornos de visión, ceguera (lesión irreversible del nervio óptico). Quemaduras en mucosas.
Quemaduras en esófago y estómago. Espasmos, vómitos, dificultades respiratorias. Riesgo de perforación intestinal y de esófago. Riesgo de aspiración al vomitar. No se descarta: shock, paro cardiovascular, acidosis, problemas renales.
Acetato de plomo II: El plomo puede formar dos compuestos con ácido acético, el acetato de plomo II y IV. Estos compuestos tienen propiedades distintas, la principal es la solubilidad en agua que presenta el acetato de plomo II, no así el acetato de plomo IV. Los dos compuestos son muy tóxicos.
Ácido Pícrico saturado: Es una solución acuosa. En contacto con la piel: Riesgo de absorción cutánea. Irritaciones. Riesgo de dermatitis. Irritaciones en mucosas de la boca, garganta, esófago y tracto intestinal.
Por ingestión de grandes cantidades: náuseas, vómitos, dolores de estómago.
Efectos sistémicos: alteraciones sanguíneas, problemas hepáticos, problemas renales.
Por ingestión de grandes cantidades: náuseas, vómitos, dolores de estómago.
Efectos sistémicos: alteraciones sanguíneas, problemas hepáticos, problemas renales.
Ácido Tricloroacético: Sustancia cáustica y corrosiva, hemostática eficaz, que aplicadas sobre la piel, mucosas o tejidos patológicos- heridas, ulceraciones, provocan destrucción de la células por acción química originando una masa o tejido muerto, alrededor actúa como irritante, dando lugar a una zona inflamada ocasionada por el medicamento.
Diseño Experimental
Experimento 4.
Separación y cuantificación de fracciones proteínicas del suero.
Objetivos:
· Aplicar la técnica de precipitación salina selectiva para separar las diferentes fracciones de proteína presentes en una mezcla.
· Determinar el porcentaje de composición de una mezcla de proteína mediante análisis colorimétrico.
Marco Teórico:
El suero es el líquido de color ámbar que se obtiene por centrifugación y o decantación de la sangre que se ha coagulado. En el proceso de coagulación se separan todas las proteínas de la coagulación (fibrinógeno), conjuntamente con las células plasmáticas.
La viscosidad del suero de debe en gran parte a la albúmina, que constituye el 55% de las proteínas totales. Junto con los electrolitos, la albúmina participa en la regulación del volumen sanguíneo, al evitar que el agua que forma parte de la sangre difunda hacia los espacios intersticiales; también participa en el transporte de ácidos grasos. Las globulinas comprenden el 38% de las proteínas plasmáticas y corresponden a los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) que liberan las células plasmáticas. La función anticuerpo representa un crucial mecanismo de defensa contra infecciones virales y bacterianas de los animales y el hombre. Tres fracciones de globulinas (alfa, beta y gamma) se pueden cuantificar y caracterizar por fraccionamiento con soluciones salinas.
Materiales y Reactivos:
- Reactivos: Suero sanguíneo, Cloruro de sodio 0.9 %, Reactivo de Biuret Solución patrón de albúmina, Sulfato de sodio 15.75%, 19.9% y 27.2%, celite.
- Materiales: Tubo de ensayo, Gotero, Pipetas 2, 5 y 10 ml, Colorímetro, Espátula, Centrifugadora.
Experimento 5
Electroforesis de proteínas del suero humano en gel de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes
OBJETIVOS:
1. Realizar la electroforesis en gel de poliacrilamida para detectar proteínas del suero.
2. Teñir el gel preparado, con azul Coomassie y con plata.
2. Teñir el gel preparado, con azul Coomassie y con plata.
MARCO TEÓRICO
Electroforesis es la migración de moléculas cargadas en solución como respuesta a la presencia de un campo eléctrico. La velocidad de migración depende principalmente de la fuerza del campo, de la carga, forma, masa y tamaño de la molécula, así como de la fuerza iónica, viscosidad y temperatura del medio en el que las moléculas se estén moviendo. Como herramienta analítica, la electroforesis es rápida, sensible y simple. La electroforesis es ampliamente usada para estudiar propiedades de especies cargadas en solución, y como una técnica de separación.
Matrices de soporte
Generalmente la muestra es corrida en matrices como papel, acetato de celulosa, geles de almidón, agarosa ó poliacrilamida. La matriz inhibe la difusión osmótica, así como el mezclado producido por convección térmica., además provee un registro del proceso electroforético ya que puede marcarse y usarse para mediciones, auto radiografía ó almacenamiento. Las matrices de soporte más ampliamente usadas (agarosa y poliacrilamida) proveen además, un medio para separar moléculas por tamaño, ya que son geles porosos y pueden actuar como tamices moleculares.
Separación de proteínas
Las proteínas son compuestos anfotéricos, por lo tanto su carga neta está determinada por el pH del medio en el que están suspendidas. En una solución con un pH por encima de su punto isoeléctrico, una proteína tiene una carga neta negativa y en un campo eléctrico migra hacia el ánodo, mientras que migrará hacia el cátodo a pHs por debajo de su punto isoeléctrico. La carga presente en una proteína es independiente de su tamaño y varía de una proteína a otra, por lo tanto, la separación electroforética de proteínas bajo condiciones no desnaturalizantes se realiza en virtud de su carga y tamaño.
Separación de proteínas bajo condiciones desnaturalizantes
El dodecil sulfato de sodio (SDS) es un detergente aniónico que desnaturaliza proteínas “envolviendo” el esqueleto polipeptídico, la unión presenta una relación de masas 1,4:1. El SDS confiere carga negativa al polipéptido en relación a su longitud. Usualmente es necesario reducir los puentes disulfuro de las proteínas para permitir la unión cuantitativa del SDS, esto se lleva a cabo en caliente con 2-mercaptoetanol. En SDS-PAGE, la migración no es determinada por la carga eléctrica del polipéptido, sino por su peso molecular.
Sistemas de amortiguadores continuos y discontinuos
Un sistema continuo tiene un gel de separación sencillo y usa el mismo amortiguador en los tanques y en el gel, en un sistema discontinuo, un gel de poro grande y no restrictivo, llamado gel de apiñamiento, es colocado en la parte superior del gel de separación, llamado gel de resolución. Cada gel está hecho con un amortiguador diferente, y el amortiguador de los tanques es diferente al de los geles. La mayor ventaja de los sistemas de amortiguador discontinuos sobre los continuos es que pueden agregarse volúmenes relativamente grandes de muestras de proteína diluida a los geles sin comprometer la resolución, esto se debe a que las proteínas son concentradas en zonas extremadamente estrechas durante su migración en el gel de apiñamiento. La resolución alcanzada con un sistema discontinuo es muy superior a la obtenida con sistema continuo.
Geles de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida se obtiene polimerizando monómeros de acrilamida (CH2=CHCONH2) en cadenas largas y entrecruzándolas con un compuesto bifuncional como N,N’-metilenbisacrilamida ( CH2(NHCOCH=CH2)2, usualmente llamada bisacrilamida). La polimerización es iniciada mediante la adición de persulfato de amonio ó riboflavina, y se usa N,N,N’,N’-tetrametilenetilendiamina (TEMED) como acelerador del proceso de polimerización. Ambos iniciadores de polimerización generan radicales libres, el persulfato de amonio espontáneamente en solución (enlace peróxido), y la riboflavina mediante foto descomposición.
El tamaño de poro efectivo de los geles de poliacrilamida depende inversamente de la concentración de acrilamida, y se usan geles con concentraciones de acrilamida desde 2.5% (moléculas con peso mayor de 106) hasta 30% (polipéptidos con peso de ~2000). Para una concentración de monómero dada, las propiedades del gel varían con la proporción de agente entrecruzador usado, al aumentar éste el tamaño de poro decrece, alcanzando un mínimo cuando representa un 5% de la cantidad total de monómero.
El tamaño de poro efectivo de los geles de poliacrilamida depende inversamente de la concentración de acrilamida, y se usan geles con concentraciones de acrilamida desde 2.5% (moléculas con peso mayor de 106) hasta 30% (polipéptidos con peso de ~2000). Para una concentración de monómero dada, las propiedades del gel varían con la proporción de agente entrecruzador usado, al aumentar éste el tamaño de poro decrece, alcanzando un mínimo cuando representa un 5% de la cantidad total de monómero.
pH
Los límites prácticos de pH para realizar PAGE están entre pH 3 y 10, ya que algunas reacciones hidrolíticas (como desaminación) ocurren a pHs extremos. La elección del pH para PAGE depende de dos consideraciones opuestas, a pHs cercanos al punto isoeléctrico de las proteínas a separar, la diferencia de carga entre ellas es grande, aumentando la posibilidad de separación, sin embargo, al ser pequeña la carga, los tiempos de corrido son largos, llevando a un aumento en el ensanchamiento de banda. En SDS-PAGE los complejos polipéptido-SDS están negativamente cargados en un rango amplio de pH, por lo tanto el pH no es crítico.
Marcaje de las bandas
Las bandas pueden ser evidenciadas mediante diferentes métodos como tinción con colorantes, revelado “fotográfico”, autorradiografía ó con marcaje fluorescente. En la presente aplicación se usará marcaje con plata, método altamente sensible y rápido. Las bandas de proteína son fijadas en la posición final después de la electroforesis precipitando las proteínas con metanol y ácido acético, las bandas son sensibilizadas con tiosulfato de sodio, que mejora el contraste entre las bandas teñidas y el fondo del gel, posteriormente el gel se trata con nitrato de plata, los iones plata se complejan con la proteína, y en un paso posterior, similar al revelado fotográfico, los iones plata complejados sufren una reducción mucho más rápida que los iones plata libres, formando partículas coloidales de plata en las dos superficies del gel, preferencialmente sobre las bandas de proteína, haciéndolas visibles. Los límites de detección son del orden de ng de proteína.
Electroforesis de proteínas del suero humano
Las proteínas presentes en el suero humano pueden agruparse en 4 fracciones dependiendo de su movilidad electroforética: Albúminas, alpha, beta y gamma globulinas.
Las albúminas del suero pertenecen a una familia multigénica de proteínas que conforman la mayor fracción de proteínas solubles en el sistema circulatorio, estas desempeñan diversas funciones fisiológicas, como regulación de la presión osmótica, transporte y distribución de un gran número de ligandos endógenos y exógenos que incluyen ácidos grasos, aminoácidos, esteroides, metales como calcio, cobre y zinc y fármacos.
La electroforesis es usada para separar las globulinas de las albúminas, ya que los niveles de cada fracción son de importancia en diagnóstico clínico. La muestra preferida es el suero, ya que el fibrinógeno contenido en el plasma a menudo obscurece cambios en los niveles de la beta y gamma globulinas. Otras muestras usadas son el fluido peritoneal u orina.
Mediante la electroforesis pueden separarse y cuantificarse unas 100 proteínas presentes en el suero, los niveles obtenidos son útiles para diagnosticar gamopatías monoclonales (asociadas al cáncer), cirrosis, hepatitis autoinmune, artritis reumática, osteomielitis, bronquitis, leishmaniosis, lepra, leucemia, enfermedades inmunológicas, SIDA, mielomas , desórdenes renales, carcinomas, infecciones agudas, diabetes, embarazo, estrés, daño celular y desnutrición entre otros estados clínicos.
Mediante la electroforesis pueden separarse y cuantificarse unas 100 proteínas presentes en el suero, los niveles obtenidos son útiles para diagnosticar gamopatías monoclonales (asociadas al cáncer), cirrosis, hepatitis autoinmune, artritis reumática, osteomielitis, bronquitis, leishmaniosis, lepra, leucemia, enfermedades inmunológicas, SIDA, mielomas , desórdenes renales, carcinomas, infecciones agudas, diabetes, embarazo, estrés, daño celular y desnutrición entre otros estados clínicos.
MATERIALES Y REACTIVOS
*Cámara de electroforesis
*Fuente de voltaje
*Enfriador a 4°C
*Solución stock monómero (Acrilamida 29,2%, bisacrilamida 0,8%)
*Amortiguador Tris-HCl 1,5M pH 8,8
*Amortiguador Tris-HCl 0,5M pH 6,8
*Amortiguador Trisbase-glicina pH 8,3 (5X)
*Solución stock SDS 10%
*Persulfato de amonio al 10% (recién preparado)
*TEMED
*Amortiguador reductor para las muestras: SDS 2-mercaptoetanol, Glicerol, Azul de bromofenol, Amortiguador pH 6,8
*Fijador A (Metanol 50%, ácido acético 5%)
*Fijador B (Metanol 50%)
*Sensibilizador (Tiosulfato de sodio 0,02%)
*Marcador (Nitrato de plata 0,1%)
*Revelador (Formaldehido 0,04%, carbonato de sodio 2%)
*Enjuagué (Acido acético 5%)
*Agua desionizada
TOXICIDAD DE LOS REACTIVOS
*Persulfato de amonio al 10%:MSDS
*TEMED:MSDS
* Tiosulfato de sodio 0,02%:MSDS
*Nitrato de plata 0,1%:MSDS
*Formaldehido 0,04%:MSDS
*Carbonato de sodio 2%:MSDS
* Ácido acético 5%:
DISEÑO EXPERIMENTAL
Experimento # 7
ESTUDIO DE INHIBICIÓN DE LA FENOLOXIDASA DE LA PAPA
OBJETIVOS:
1. Determinar la actividad enzimática de la fenoloxidasa presente en extractos de papa.
2. Calcular la Km de la enzima de los datos de actividad enzimática, frente a diferentes concentraciones de sustrato.
3. Estudiar el tipo de inhibición que ejerce el ácido benzoico sobre la actividad de la fenoloxidasa de la papa.
MARCO TEÓRICO
Las enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, químicamente son proteínas. Como catalizadores, las enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan indefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran su consecución.
La característica más sobresaliente de las enzimas es su elevada especificidad. Esta es doble y explica que no se formen subproductos: (1) Especificidad de sustrato. El sustrato (S) es la molécula sobre la que el enzima ejerce su acción catalítica. (2) Especificidad de acción. Cada reacción está catalizada por un enzima específico.
La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que representa el estado de transición.
La velocidad de reacción está dada por la ecuación:
Donde V0 es la velocidad inicial del proceso
V0 = Vmáx [S]
KM + [S]
[S] = concentración de sustrato
KM = constante de Michaelis – Menten
Vmáx = velocidad máxima
Los estudios de inhibición enzimática clásica reversible implican el análisis gráfico de los recíprocos de las velocidades iniciales 1/Vo y de las concentraciones de sustrato 1/ [S]
MATERIALES Y REACTIVOS
- Baño termométrico
- Tubos de ensayo y gradilla
- Bureta de 50 mL, goteros, pipetas de 5 y 10 m
- Erlenmeyer de 125 mL
- Gaza, embudo buchner
- licuadora
- espectrofotómetro visible
Una papa congelada.
ac. Benzoico 0.02%, Sulfato de Amonio 60 – 70%.
TOXICIDAD DE LOS REACTIVOS
· Pirogalol al 1 %: en la piel ¡PUEDE ABSORBERSE! Cambio de color local de la piel, enrojecimiento, dolor. Por ingestión causa Náusea, dolor abdominal, vómitos, debilidad.
· Amortiguador citrato 0.1 M de pH 6: Peligroso en caso de inhalación. La sustancia es tóxica para las membranas mucosas. Levemente peligroso en caso de contacto con la piel (Irritante).
·NaF 1%: Muy tóxico por ingestión, inhalación y la piel. Puede causar quemaduras. Irritación severa de los ojos. La exposición crónica puede causar daño pulmonar.
· Ác. Benzoico 0.02%: Nocivo, Combustible, Reactivo e Irritante leve. Ligeramente soluble en Agua. Por Ingestión: Náuseas y trastornos gastroentéricos.
· Sulfato de Amonio al 60 – 70%: El contacto prolongado con este producto puede producir irritación en los ojos y la piel. Por inhalación puede causar irritación del tracto respiratorio. La ingestión de esta sustancia puede producir irritación del tracto gastrointestinal, caracterizado por quemaduras y diarrea. Tiene efectos cancerígenos y es mutagénico.
EXPERIMENTO 8.
DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE CARBOHIDRATOS
Objetivos:
1. Realizar pruebas cualitativas para detectar carbohidratos con base en la formación furfural.
2. Ensayar la prueba para azúcares reductores.
3. Realizar pruebas cualitativas para polisacáridos.
Marco Teórico:
Los carbohidratos son compuestos orgánicos, formados primordialmente por carbono, hidrógeno y oxígeno. Se encuentran en muchos productos naturales y son una de las fuentes principales de energía para los organismos quimiotróficos.
La unidad fundamental de los carbohidratos son los monosacáridos, estos son polihidroxialdehídos o polihidroxicetonas.
Cuando la reacción de deshidratación se efectúa con la ayuda del ácido sulfúrico concentrado y el color se desarrolla con alfa naftol, la prueba se denomina reacción de Molisch.
Materiales y Reactivos
a).Tubos de ensayo, gradillas, goteros, probetas, vasos químicos.
b).Soluciones al 1% de glucosa, fructuosa, lactosa, almidón, reactivo de Benedict, Lugol, alfa –Naftol en etanol, H2SO4 conc., reactivo de Bial, reactivo de Seliwanoff, reactivo de Barfoed.
TOXICIDAD DE LOS REACTIVOS
EXPERIMENTO 9.
AISLAMIENTO DEL GLUCÓGENO
OBJETIVOS:
1. Extraer el glucógeno presente en una muestra de hígado de pollo.
2. Caracterizar mediante pruebas químicas el glucógeno extraído.
MARCO TEÓRICO:
El glucógeno es un polisacárido de la célula animal, que se encuentra en el hígado (10%) y músculos (2%). La estructura del glucógeno y los polisacáridos similares se puede describir como una ramificación en forma de abanico de moléculas de gucopiranosa, por medio de enlaces 1-6 en los puntos de ramificación.
Estructura ramificada de glucógeno
Presenta ramificaciones cada 8-12 glucosas con una cadena muy larga (hasta 300.000 glucosas). Se requiere dos enzimas para su hidrólisis (Glucogenofosforilasa) y alfa (1-6) glucosidasas, dando lugar a unidades de glucosa. Dado que los seres vivos requieren una parte constante de energía, una parte importante de metabolismo de los azucares está relacionado con los procesos de formación de almidón y glucógeno y su posterior degradación.
MATERIALES Y REACTIVOS.
*Hígado de pollo,
*Cuchillo,
*Matraz Erlenmeyer de 250 mL y 500 mL
*Probetas
*Baño María,
*Plancha
*Centrifugadora,
*Vasos químicos
*Tubos de ensayo.
*KOH al 50 %
*Etanol al 95 %
*Reactivo de Molisch.
TOXICIDAD DE LOS REACTIVOS
*KOH al 50 %:MSDS
*Etanol al 95 %:msds
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